Técnicas

La
pro01
Unidad de Proteómica dispone de tecnologías y personal técnico cuyo objetivo fundamental es poner a disposición de la comunidad científica y de las empresas que lo requieran, el soporte instrumental y el asesoramiento científico sobre técnicas experimentales utilizadas en el campo de la proteómica. Las técnicas instrumentales disponibles actualmente son:
  • Espectrofluorimetría.
  • Espectrometría de flujo detenido (Stopped-flow).
  • nano-HPLC-Espectrometría de masas de trampa de iones.
  • SELDI-TOF-MS (Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time Of Flight Mass Spectrometry.

Aplicaciones

Los equipos presentan las siguientes prestaciones o aplicaciones:
  • Registro de espectros de excitación y emisión de fluorescencia.
  • Registro de cinéticas de emisión de fluorescencia.
  • Medidas de polarización/anisotropía de fluorescencia.
  • Registro de cinéticas rápidas por espectroscopía de flujo detenido.
  • Valoración del ion Ca2+ intracelular mediante detección simultánea de dos longitudes de onda de emisión.
  • Experimentos de transferencia de energía de resonancia por fluorescencia (FRET).
  • Purificación de proteínas y péptidos.
  • Caracterización de masas moleculares de péptidos y proteínas.
  • Identificación de proteínas.
  • Secuenciación de novo de proteínas.
  • Caracterización de modificaciones postraduccionales de proteínas.
  • Determinación estructural de productos naturales y metabolitos.
  • Análisis de hidrolizados de proteínas y separación de aminoácidos por HPLC.

Aplicaciones concretas del equipo SELDI-TOF:

  • Búsqueda de biomarcadores.
  • Perfiles proteicos.
  • Monitorización de protocolos de purifación de proteínas.
  • Control de calidad de proteínas purificadas.
  • Mapas peptídicos.
  • Ensayos ligando-receptor.
  • Interacciones proteína-DNA.
  • Caracterización de proteínas.
  • Interaciones proteína-proteína.
  • Estudios de modificaciones post-traduccionales.

Equipamiento

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nano-HPLC Agilent 1200-Espectrómetro de masas de trampa de iones (ESI-Trampa iónica) HCT ultra Bruker Daltonics

Consta de un espectrómetro de masas con analizador por trampa de iones y fuente de ionización a presión atmósférica por electrospray (ESI) o electronebulización. ESI es una técnica de ionización para pequeñas cantidades de moléculas como péptidos, proteínas o polímeros. El espectrómetro irá precedido de un sistema de cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) con nanoflujo (nano-HPLC) que permite la separación de péptidos antes de ser inyectados hacia la fuente de ionización, así como la eliminación de pequeñas cantidades de contaminantes (sales, detergentes) que interfieren con el análisis. Los péptidos son inyectados y retenidos en una columna C18 y secuencialmente liberados e ionizados. El analizador es capaz de ir fragmentándolos de manera automática de modo que podemos identificar la proteína o la mezcla de proteínasinicial. El sistema está optimizado para aplicaciones de identificación, caracterización y secuenciación de novo de proteínas, así como para determinación estructural de moléculas pequeñas, del tipo de productos naturales, metabolitos, etc.
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Digestor automatico de proteinas Digestpro MSI, Intavis Bioanalytical Instruments

Este robot permite realizar bajo condiciones controladas y automatizadas la digestión con tripsina de proteinas en solución o previamente separadas en geles de poliacrilamida mono o bidimensionales, teñidos con Azul de Coomassie o con plata. Así mismo, el sistema permite la extracción de los péptidos para su posterior análisis por espectrometría de masas.
Este robot permite realizar bajo condiciones controladas y automatizadas la digestión con tripsina de proteinas en solución o previamente separadas en geles de poliacrilamida mono o bidimensionales, teñidos con Azul de Coomassie o con plata. Así mismo, el sistema permite la extracción de los péptidos para su posterior análisis por espectrometría de masas.
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SELDI-TOF, ProteinChip Seldi System Personal Edition Bio-Rad


SELDI-TOF-MS (Surface Enhanced Laser Desorption /Ionization Time Of Flight Mass Spectrometry) es una técnica de análisis de proteínas introducida por primera vez por Hutchens y Yip (1993). El empleo de superficies cromatográficas junto con la especificidad y reproducibilidad de la espectrometría de masas permite la rápida obtención de perfiles proteicos a partir de muestras biológicas complejas.
Esta tecnología está basada en la separación cromatográfica de las proteínas en función de sus propiedades físicas y químicas (hidrofobicidad, hidrofilicidad, pI, afinidad por metales…) y su posterior análisis por espectrometría de masas en “tiempo de vuelo” (TOF-MS). El principio es muy simple. Una pequeña cantidad de la muestra de interés es depositada en la superficie cromatográfica (ProteinChip array), donde es incubada y finalmente lavada con los tampones adecuados. Las proteínas de interés son retenidas en dicha superficie, mientras que las proteínas no unidas o unidas inespecíficamente son eliminadas en la etapa de lavado junto a sales y otros contaminantes que pudieran interferir en el posterior análisis. En la última etapa se lleva a cabo un análisis por TOF-MS con un láser de N2, para ionizar la muestra que ha sido previamente co-cristalizada con las moléculas de la matriz en la superficie del array. Tras el procesamiento post-análisis de los datos se obtiene un espectro de masas como resultado de la representación gráfica de la intensidad (I) frente a la relación masa/carga. El uso de distintos ProteinChips permite el subfraccionamiento de las proteínas de la muestra reduciéndose así la complejidad y facilitando el análisis. La comparación directa del espectro de masas entre muestras analizadas en paralelo y en las mismas condiciones (p. ej. control vs paciente, células control vs células tratadas con fármacos) permite la identificación de biomarcadores diferencialmente expresados.
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Espectrofluorímetro PTI QM-2000-6 y Stopped-Flow de Bio-Logic

Espectrofluorímetro de extraordinaria sensibilidad y con formato en T con dos canales de emisión, lo que permite detectar simultáneamente dos señales de emisión de flurorescencia diferentes. El aparato permite registrar espectros de excitación y emisión de fluorescencia, cinéticas y medidas de polarización y anisotropía de forma automática con polarizadores de calcita para UV-VIS. El equipo dispone de lámpara de Xe de 75W, monocromador de emisión controlado por ordenador y compartimiento de muestra con agitador magnético y termostatización por sistema Peltier. El equipo posee una relación señal/ruido de 6000:1 (banda Raman del agua) y su diseño modular permite la actualización a equipo de medida de tiempos de vida de fluorescencia, cinéticas rápidas Stopped-Flow, espectroscopía con microscopio de epifluorescencia y medida de fluorescencia en placas ELISA de 96 pocillos.
El módulo de Stopped-Flow de Bio-Logic se conecta mediante interfase de conexión óptica al espectrofluorímetro QM-2000 de PTI. Sistema de nuevo diseño con tiempo muerto de 0,8 ms y volumen de trabajo optimizado de 50 μl. Como accesorios disponemos de dos jeringas de vidrio de 10 ml y dos de 1 ml. El sistema posee un mezclador de líquidos de alta densidad y opera con microvolúmenes. Regulación de la temperatura de 0,1 ºC. Permite el seguimiento de cinéticas rápidas por fluorescencia. El sistema es ampliable con los módulos adecuados a polarización/anisotropía, dicroísmo circular y espectrómetros de array de diodos de alta velocidad.

Personal Proteómica



Daniel Torres
D. Daniel Torres Fernández
Técnico responsable
phone_icon40px +34 952 13 2210 / 2364
email_icon40px dtorres@uma.es
Ubicación Edificio SCAI, Planta 2

Foto Mercedes Martín
D. Mercedes Martín Rufián
Técnico
phone_icon40px +34 952 13 2210 / 2364
email_icon40px mercherub@uma.es
Ubicación Edificio SCAI, Planta 2

Javier Márquez
Dr. Javier Márquez Gómez
Responsable científico
phone_icon40px +34 952 13 2027 / 1930
email_icon40px marquez@uma.es
Ubicación Dpto. Bioquímica - Fac. Ciencias
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