La Proteómica es esencialmente el estudio y caracterización de todo el conjunto de proteínas (proteoma) expresadas por un genoma, con el fin de obtener una visión global integrada de los procesos celulares. El proteoma de una célula varía según el estado en que se encuentre, de manera que en cada momento y en cada tipo celular el perfil de proteínas expresadas será diferente. Las proteínas pueden identificarse y clasificarse con respecto a su función e interacciones entre ellas, y de este modo es posible caracterizar las redes funcionales que establecen y su dinámica durante los procesos fisiológicos y patológicos.

El principal objetivo de la Unidad de Proteómica es proporcionar apoyo y asesoramiento científico-técnico a la comunidad universitaria y a otras instituciones públicas o privadas en la identificación y caracterización de proteínas, así como de otras biomoléculas, fundamentalmente mediante técnicas de espectrometría de masas. La espectrometría de masas está basada en el comportamiento diferencial que presentan las moléculas ionizadas al atravesar campos eléctricos y magnéticos. Esta técnica permite que dichos iones sean separados en función de su relación masa/carga (m/z) y detectados posteriormente.

Mediante espectrometría de masas es posible obtener información estructural de las proteínas, tal como su masa o la secuencia de aminoácidos que la forman. Esta información puede utilizarse para identificar proteínas mediante la búsqueda en bases de datos. La espectrometría de masas también resulta útil para identificar y localizar modificaciones post-traduccionales en las proteínas.

La Unidad de Proteómica cuenta con dos plataformas en las que se acopla la nano-Cromatografía Líquida a diferentes espectrómetros de masas (trampa iónica, cuadrupolo-orbitrap y tiempo de vuelo), que difieren en el método de ionización de la muestra. Los métodos que se emplean en nuestra unidad para generar iones desolvatados son el MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption / Ionization) y el ESI (Electrospray Ionization). Tanto el MALDI como el ESI son métodos de ionización suaves donde se mantiene relativamente la integridad de la muestra. El tándem cromatografía líquida y espectrometría de masas posibilita además la identificación de mezclas proteicas complejas y su cuantificación.

La Unidad está equipada también con equipos de Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento (HPLC) y Cromatografía Líquida de Media Presión (FPLC) que posibilitan la separación, purificación y cuantificación de proteínas y otros analitos.

Además, la Unidad está dotada de un analizador multiparamétrico Bio-Plex que permite la cuantificación y la detección simultánea de distintas proteínas secretadas (citocinas, quimiocinas, factores de crecimiento, etc.) y resulta una herramienta ideal para el estudio integral de sistemas biológicos. Esta tecnología de alto rendimiento produce resultados comparables a los tradicionales ELISAs, pero con mayor eficacia, velocidad e intervalo dinámico.

Espectrometría de Masas mediante Cuadrupolo-Orbitrap

El Espectrómetro de Masas Híbrido Cuadrupolo-Orbitrap Q Exactive™ HF-X (Thermo Scientifi) combina un analizador de masas Orbitrap de alta resolución y masa exacta (HRAM) de ultra-alto rendimiento, con un tubo de transferencia de alta capacidad, un embudo de iones electrodinámico y un cuadrupolo de alto rendimiento para la selección de iones precursores, ofreciendo una velocidad y una sensibilidad de primera clase, permitiendo la identificación y cuantificación de proteínas en un solo análisis y con un solo instrumento.

La Disociación Colisional Acelerada de Alta Energía (aHCD) permite una velocidad de adquisición MS/MS de hasta 40Hz. La tecnología de cuadrupolo avanzada (AQT) optimiza la selección y transmisión de iones precursores, mejorando la cuantificación de iones de baja abundancia en las matrices más complejas. Los sofisticados métodos de Monitoreo de Reacción Paralela (PRM) y Adquisición Independiente de Datos (DIA) proporcionan resultados de cuantificación reproducibles a la vez que una confianza cualitativa completa. Posee un poder de resolución máximo de 240.000 a m/z 200 (FWHM). Permite los siguientes modos de operación: Full Scan, Selected Ion Monitoring (SIM), Parallel Reaction Monitoring (PRM), Data-Independent Acquisition (DIA), All Ion Fragmentation (AIF), In-source fragmentation y Data-Dependent Acquisition (DDA).

Espectrometría de Masas mediante Trampa de Iones

La complejidad de las muestras proteómicas como consecuencia de modificaciones postraduccionales precisa gran velocidad y sensibilidad para recopilar tantos péptidos como sea posible. La trampa de iones amaZon speed ETD (Bruker Daltonics) posee estas cualidades, permitiendo además el modo de fragmentación ETD (Electron-Transfer Dissociation) y PTR (Proton-Transfer Reaction).

Muchas proteínas ejecutan su función molecular mediante modificaciones postraduccionales (PTM) como, por ejemplo, las fosforilaciones. La identificación y la localización inequívoca del sitio de modificación es de gran importancia para comprender el contexto biológico de las proteínas. La tecnología de fragmentación ETD conserva las modificaciones del esqueleto peptídico y, por lo tanto, permite la asignación clara del sitio de modificación.

Espectrometría de masas MALDI-TOF/TOF

El espectrómetro de masas MALDI-TOF/TOF UltrafleXtreme (Bruker Daltonics) es una plataforma que usa la tecnología MALDI-TOF/TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization - Time-Of-Flight) para la ionización de las moléculas. Para ello se hace incidir un haz de luz láser sobre la muestra y se favorece su ionización mediante la adición de una matriz sólida. Un primer análisis MS determina el valor m/z de los analitos, algunos de los cuales son seleccionados, aislados y fragmentados. Los fragmentos generados se separan y analizan en un segundo análisis MS obteniendo un espectro MS/MS de cada analito seleccionado. Los espectrómetros de masas de tipo MALDI TOF/TOF son muy utilizados para identificar proteínas por varias razones: son altamente sensibles, cuentan con un elevado poder de resolución y son capaces de medir con excelente exactitud la masa.
El espectrómetro UltrafleXtreme ofrece resoluciones próximas a 40.000 en modo reflectrón, en un rango de masas amplio, permitiendo alcanzar una exactitud de masas de 50-60 ppm en el modo lineal y en torno a 1,5 ppm en el modo reflectrón con calibración interna. La sensibilidad alcanzada es en torno a 0,25 fmoles en el rango de 1.000 a 4.000 Da con una relación señal/ruido en torno a 200.

Espectrometría MALDI-Imaging

La técnica de MALDI-Imaging es una potente herramienta que permite determinar la distribución espacial y abundancia relativa de cientos de analitos (proteínas, péptidos, lípidos, metabolitos, fármacos) en muestras intactas de tejidos animales o vegetales, en un único experimento, y su correlación con información histológica.

Una vez aplicada la matriz orgánica sobre secciones de tejido, la desorción de las moléculas presentes en los cristales de la mezcla muestra-matriz se consigue mediante disparos de láser en cada píxel siguiendo un patrón bidimensional. Los espectros obtenidos en cada posición del corte de tejido contienen información sobre la masa molecular y la intensidad relativa de los analitos presentes, que se pueden representar como una función de la localización (píxel) para generar mapas de densidad de cada valor de m/z. La comparación de la tinción de hematoxilina-eosina de las secciones de tejido con los mapas de densidad permite la correlación histológica en la cual la distribución de las moléculas se puede asignar a distintas estructuras anatómicas dentro del tejido.

El análisis de analitos en cortes intactos de tejido se lleva a cabo con un espectrómetro MALDI-TOF/TOF UltrafleXtreme (Bruker Daltonics). La aplicación de la matriz orgánica o de proteasas se realiza mediante nebulización vibracional con un sistema ImagePrep (Bruker Daltonics). Para la obtención de las secciones de tejidos frescos congelados se utiliza un criostato Leica CM-1950. Los cortes se colocan sobre porta-objetos conductivos ITO (Bruker Daltonics).

La proteómica constituye hoy en día una de los principales campos de investigación en el área de las Ciencias de la Vida, con aplicaciones en entornos muy diversos. En el campo de la Biomedicina se pueden destacar las siguientes aplicaciones:

• Identificación de biomarcadores para el desarrollo de métodos de diagnóstico y pronóstico de enfermedades.
• Búsqueda de dianas terapéuticas para el desarrollo de nuevos fármacos y vacunas.
• Determinación de mecanismos moleculares involucrados en la patogénesis de enfermedades.
• Clasificación de tumores.
• Distribución de fármacos en tejidos.
• Identificación de microorganismos.
• Estudios ecológicos y evolutivos.