Microscopía Confocal y Ciitometría

Microscopía Confocal y Citometría

Técnicas

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Podemos decir que la especie humana prácticamente desde siempre ha intentado ver más de lo que es capaz. Podemos empezar antes de J.C. con Confucio, pasando por las piedras de lectura de la edad media o Marco Polo, hasta el nacimiento del microscopio gracias a los Janssen. Fue a partir del siglo XVI cuando empezó a utilizarse el microscopio con fines científicos gracias a Leevenhoke, Hokke, y muchos otros.

La microscopía óptica es una técnica básica para la ciencia. Podemos hablar de microscopios simples o lupas y microscopios compuestos. El microscopio óptico ha evolucionado desde su nacimiento dando lugar a distintos tipos de microscopía como son las de contraste de fases, DIC, campo oscuro, fluorescencia, confocal o super-resolución.

La microscopía confocal utiliza como fuente de iluminación uno o varios láseres, detectores de luz, fotomultiplicadores, y una barrera física, pinhole, que evita llegue al detector luz procedente de los planos diferentes al de foco. La imagen se forma por un barrido punto a punto de la muestra, consiguiendo de esta forma imágenes con mayor resolución.

La citometría de flujo es una tecnología que nació a mediados del siglo XX y que en un principio sólo se usaba para su aplicación científica. Consiste en hacer pasar células de forma individual por un haz de luz generado por un láser; esta interacción da lugar a la transmisión, dispersión y emisión de luz la cual es recogida por diferentes detectores para su posterior análisis. Gracias a ello podemos diferenciar de forma prácticamente instantánea diferentes poblaciones celulares incluidas en nuestra suspensión celular. Los primeros equipos comerciales son de los años 70. Se trata de una herramienta analítica empleada en el recuento y clasificación de células según sus características morfológicas y por la presencia de biomarcadores . Hoy día, esta técnica es utilizada de forma rutinaria en muchos centros de salud para el diagnóstico y seguimiento de muchas enfermedades, además tiene muchísimas otras aplicaciones en investigación y en ensayos clínicos. Una variante muy solicitada de esta técnica es la separación celular que consiste en la separación física de células o partículas según sus propiedades, empleándose por ejemplo para purificar poblaciones de interés.

Aplicaciones

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Microscopio de campo claro y epifluorescencia

  • Visualización y adquisición de imágenes de cortes de tejidos animales y vegetales y células en cultivo.
  • Visualización y adquisición de imágenes de fibras y superficies de materiales.
  • Adquisición de imágenes virtuales de preparados microscópicos completos, tanto en campo claro como en fluorescencia y en distintos planos z así como con todos los objetivos que dispone el equipo (Olympus VS120, docencia).
  • Base de datos de imágenes virtuales de preparados microscópicos, tanto en campo claro como en fluorescencia (Olympus VS120, docencia).

Microscopía confocal


  • Adquisición de imágenes de marcajes fluorescentes en células en cultivo y cortes de tejidos animales y vegetales.
  • Adquisición de imágenes de fibras y superficies de materiales.
  • Análisis de colocalización.
  • Obtención de secciones ópticas en serie para reconstrucción pseudo 3D y 3D.
  • Estudio de células y tejidos vivos con marcajes fluorescentes.
  • Estudio de movimiento (FRAP) o interacción (FRET) de moléculas en tejidos y células.

Citometría de flujo


  • Análisis de la distribución de tamaños y complejidad celular.
  • Detección de distintos tipos celulares determinados por medio del marcado con diferentes fluorocromos. Este marcado puede hacerse mediante anticuerpos que reconocen antígenos de superficie o expresando proteínas fluorescentes en el interior de las células.
  • Análisis del ciclo celular en una población mediante la detección de la cantidad de ADN presente en cada célula.
  • Separación de hasta cuatro poblaciones celulares a la vez, diferenciadas a partir de una suspensión celular. La separación se puede realizar en diferentes tipos de tubos, así como en diferentes tipos de placas multipocillos.
  • Obtención de clones celulares mediante separación de células individuales.
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Equipamiento

El equipamiento disponible:
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    FacSort

    Citómetro FACSort (Becton-Dickinson)

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    • •Un láser de argón refrigerado por aire de 15 mW un pico de emisión, en 488nm.
    • 1 fotoreceptor para la luz transmitida (FSC).
    • 4 fotomultiplicadores, 1 de ellos para captar la luz dispersada (SSC) y 3 fluorescencias: Fl1 (530/30), Fl2 (585/42) y Fl3 (650LP).
    • Programa para visualización de los datos CellQuets.
    • Dispensador de muestra totalmente automatizado, para tubos de 15ml de base redonda.
    • Separación celular.
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  • Stacks Image 32218
    Leica DMIL

    Microscopio invertido de fluorescencia DMIL (Leica)

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    • Objetivos: HI Plan 4x, 20x, 40x y 63x.
    • Oculares: 10x/18
    • Fuentes de luz transmitida: halógena 6V y 35W.
    • Iluminación para sistema de epifluorescencia (lámpara de mercurio de arco corto HBO de 50W).
    • Bloques de filtros DAPI (A Ex BP340-380, DM 400 Em LP425), TRITC (N2.1 Ex BP515-560, DM 580 Em LP590) y FITC (I3 Ex BP420-490, DM 510 Em LP515).
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  • Stacks Image 32268
    Leica SP5

    Microscopio confocal SP5 II (Leica)

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    • Microscopio invertido Leica DMI 6000 CS Bino.
    • Objetivos: 10x, 20x , 40x inmersión aceite, 63x inmersión aceite, 63x inmersión glicerol y 100x inmersión aceite.
    • Oculares: 10x/20
    • Iluminación transmitida (12V 100W).
    • Contraste de fases paran todos los objetivos y contraste de fases interferencial (DIC) para todos los objetivos salvo el 10x.
    • Iluminación para sistema de epiflorescencia EL6000(lámpara de mercurio de larga vida) y filtros para visualizar I3 (FITC), N2.1 (Rodamina) y A (DAPI). 
    • Bancada láser que incluye los láseres:
    • Ar de 100 mW con líneas de emisión en 458, 476, 488, 496 y 514 nm.
    • DPSS 561 nm.
    • HeNe 2 mW 594nm.
    • HeNe 10 mW 633nm.
    • Diodo 50 mW 405 nm.
    • Platina galvanométrica SúperZ tipo H, con un rango de movimiento de 500 micras y paso de 3 nm.
    • Módulo de excitación con AOBS, gracias al cual se eliminan los filtros de excitación.
    • Módulo confocal de scanner para cuatro canales, cada uno de ellos dotado con un fotomultiplicador. Dispone de un sistema espectral de detección, totalmente modulable, con un paso mínimo de 2 nm.
    • También incluye un módulo adicional para la luz transmitida que permite la digitalización de imágenes en cualquiera de las modalidades de las que dispone el microscopio (campo claro, polarización y DIC).
    • Todo el sistema está controlado por un programa informático, Leica LAS AF que facilita la obtención y manejo de las imágenes capturadas. Incluye como módulos adicionales análisis FRAP, FRAP XT, FRET y estudio de células in vivo con una cabina de marca Okolab.
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  • Stacks Image 32281
    Leica TCSNT

    Microscopio confocal TCS NT (Leica)

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    • Microscopio invertido Leica DMIRB.
    • Objetivos: 5x, 16x multi-inmersión 20x, 40x, 40x inmersión, 63x inmersión.
    • Oculares: 10x/20
    • Iluminación transmitida (12V 100W).
    • Iluminación para sistema de epifluorescencia (lámpara de mercurio de alta presión, 50W y filtros para visualizar I3-FITC, N2.1-Rodamina y UV).
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  • Stacks Image 32292
    MoFlo

    Citómetro MoFlo (DakoCytomation)

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    • Dos láseres: Coherent Enterprise II con dos picos de emisión, uno en 488 nm y otro entre 351 y 364 nm, y diodo rojo con pico de emisión en 635 nm.
    • 1 fotoreceptor para la luz transmitida (FSC).
    • 8 fotomultiplicadores, 1 de ellos para captar la luz dispersada (SSC) y 7 fluorescencias: 3 para la luz azul, 2 para la ultravioleta y 2 para la roja.
    • Boquillas para diferentes tamaños de partículas o células, 50, 70, 100, 200 y 400 micras.
    • Programa para visualización de los datos Summit, v. 4.0.
    • Dispensador de muestra totalmente automatizado, Smart Sampler, con posibilidad de usar tubos de 0,5 ml., 1,5 ml., 5 ml. base redonda, 14 ml. base redonda, 15 ml. base cónica o 50 ml. base cónica.
    • Separación celular hasta en 4 vías simultáneamente.
    • Aplicación para calibración de la separación, Cyclone.
    • Aplicación para control automático de la separación, Sort Master.
    • Posibilidad de hacer la separación tanto en tubo como en portas o placas multipocillos.
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  • Stacks Image 32307
    Nikon AZ100

    Microscopio Multizoom AZ-100 (Nikon)

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    • Objetivos: 1x (DIC), 2x y 5x.
    • Oculares: 10x/25.
    • Iluminación diascópica (12V 100W).
    • Sistema de contraste interferencial Nomarski (DIC).
    • Iluminación para sistema de epifluorescencia (lámpara de mercurio de alta presión, 100W y CoolLED’s pE-300).
    • Bloques de filtros UV-2A (EX 330-380; DM 400; BA 420), GFP-B (EX 460-500; DM 505; BA 510-560), G-2A (EX 510-560; DM 575; BA 590).
    • Cámara digital Nikon Digital Sight DS-5Mc refrigerada, conectada al microscopio y a un ordenador (PC) donde está instalado el programa Nis-Elements diseñado para la captación, almacenaje y tratamiento de fotografías.
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  • Stacks Image 32320
    Nikon E800

    Microscopio Eclipse E 800 (Nikon)

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    • Objetivos: 2x, 4x, 10x (DIC), 20x (DIC), 40x (DIC), 60x (DIC) inmersión y 100x (DIC) inmersión.
    • Oculares: 10x/25.
    • Iluminación transmitida (12V 100W).
    • Sistema de contraste interferencial Nomarski (DIC).
    • Iluminación para sistema de epifluorescencia (lámpara de mercurio de alta presión, 100W y CoolLED’s pE-300).
    • Filtros para visualizar TRIC (EX 540/25; DM 565; BA 605/55), FITC (EX 465-495; DM 505; BA 515-555), DAPI (EX 340-380; DM 400; BA 435-485)y UV-2A (EX 330-380; DM 400; BA 420).
    • Cámara digital de alta resolución, Nikon DXM1200, conectada al microscopio y a un ordenador (PC) donde está instalado el programa ACT-1 diseñado para la captación, almacenaje y tratamiento de fotografías.
    • Cámara digital refrigerada de alta resolución, Leica DFC450, conectada al microscopio y a un ordenador (PC) donde está instalado el programa LAS-AF diseñado para la captación, almacenaje y tratamiento de fotografías.
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  • Stacks Image 32333
    Olympus VS120

    Sistema de microscopia virtual y telepatología VS120 (Olympus)

    Stacks Image 32338
    • Objetivos PLAN AP 2x, 10x, 20x, 40x y 60x inmersión en aceite.
    • Revolver motorizado, set de polarización, condensador motorizado.
    • Pletina motorizada X,Y, rango de movimiento:155.5mm(X)x 85.5mm(Y), Pitch 4mm.
    • Sistema de iluminación X-Cite para fluorescencia.
    • Filtros para visualizar DAPI/FITC/Cy3/Cy5 (Excitación 410/504/582/669 bandpass, 440/521/607/700 Beam splitter, 387/11, 485/20, 560/25, 650/13).
    • Cámara digital VC50 refrigerada.
    • Cámara Olympus VS-XM10 monocromo.
    • Programa informático VS de Olympus para la adquisición de imágenes tanto en campo claro como en fluorescencia.
    • Programa informático VS-NIS-SQL-V2.6 para gestión y base de datos de preparaciones virtuales.
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